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工业生物过程高效转化与系统集成

时间:2018-05-29来源:未知 作者:谭天伟 秦培勇 点击:

工业生物技术是以生物学、化学和化学工程学等学 科为基础、以生物催化和生物转化为核心,研究大规模 生产化学品、医药、能源和材料的新过程和新方法的学 科,是以可再生生物质资源为原料的、环境友好的新型 物质加工模式,是化学工程和生物技术有机结合的新制 造技术的典范[1]。随着能源、资源、环境问题的日趋严 峻,工业生物技术已经成为世界各国的战略研究方向。

我国在工业生物过程优化和系统集成研究方面 与国外差距较大,具体表现在原料利用率和产品回 收率低、能量消耗高,发酵工业排放COD(化学需 氧量)占全国工业COD总排放量的19%。主要原因 是工业生物过程是一个具有生命特征的动态复杂系 统,目前对多变、复杂生物原料的定向/高效转化 机制还不十分清楚,导致生物转化体系效率低、副 产物多、COD排放高;产物浓度低,导致分离精制 能耗高、收率低;生物过程子系统中物质流和能量 流的割裂设计,以及对整个工业生物过程缺乏系统 科学研究,导致整个系统高能耗、高物耗、高排放、 整体经济性差。

针对上述问题,国内工业生物技术主要优势单 位包括北京化工大学、天津大学、江南大学、中国科 学院过程工程研究所、清华大学、华东理工大学、南京工业大学、中国科学院天津工业生物技术研究所 等于2013年联合承担了“973”项目“工业生物过程 高效转化与系统集成的科学基础研究”,经过几年的 联合攻关,在生物原料高效/定向转化机制、工业生 物过程物质/能量流耦合规律、工业生物过程强化和 系统集成原理3个关键基本科学问题研究方面取得一 定的成就;探究出如何实现复杂生物原料高效与定向 转化,过程强化和系统集成,为实现工业生物全流程 “吃得净、吃得快、排的少”奠定方法基础(图1)。

1 生物原料高效转化是可持续发展的重要发 展方向

目前,我国非粮生物质资源丰富,其高效转化与利用具有巨大的发展空间[2-3]。但生物质原料成分 复杂,可能含有有毒代谢物和重金属离子对目标微生 物产生外界压力,而微生物细胞在受到外界压力和危 险时能够立即采取“应激”行为,因此需要对微生物 高效转化及胞内/胞外代谢“应激”机制进行解析。

天津大学等单位针对劣质生物原料中存在多种 抑制剂的问题,研究了酿酒酵母菌株对复合抑制剂 的“应激”机制[4] ;发现纤维素转化过程中会有多 种抑制剂产生[5-7],解析复合抑制剂的耐受机制对纤 维素高效生物转化具有重要的意义。国际上,美国 农业部研究中心和苏黎世理工大学也在这方面展开 研究。国外单位主要是针对单一抑制剂成分的抑制 机理进行解析。天津大学从实际生产过程出发,解 析水解液中复合抑制剂的耐受机制,选育了复合抑 制剂耐受菌株菌种,建立了酿酒酵母对抑制剂的耐 受能力快速提升策略[8] ;获得了针对纤维素水解液 中抑制剂的典型代表(1.3g/L糠醛、1.5g/L苯酚和 5.3g/L乙酸的混合物)的耐受菌株,在抑制剂存在 下发酵周期由141h缩短到21h[8-9],申请了中国发明 专利(CN201110238038.90);发现了新的抑制剂耐 受机制,通过解析抑制剂耐受菌株和原始菌株的差 异,以及菌株对抑制剂的响应,建立了酿酒酵母耐 受抑制剂的机理模型[10-12] ;发现了肌醇和脯氨酸是 与菌株耐受性相关的重要代谢物,通过降低和提高 肌醇和脯氨酸的含量可以显著降低和提升菌株的复 合抑制剂耐受能力,并同时发现了活性氧是脯氨酸 调控菌株耐受能力的关键中介[9]。

总之,在复杂生物原料体系中系统研究胞内/胞 外代谢物互补调控的规律,有助于提高微生物对生 物质的转化效率、减少污染、降低成本。突破传统 利用优质生物原料制备单一产品的模式,实现劣质 生物质原料的高效和充分利用及产出的利益最大化。

2 物质/ 能量流高效利用是提高工业生物过 程转化效率的重要途径

传统提高目标产物生产效率的主要方法是强化 微生物胞内代谢网络。事实上,若只对物质代谢 网络进行强化,结果常常不尽人意。造成该现象 的主要原因之一是微生物胞内能量因子(如ATP、 NADH和NADPH等)与物质流代谢不匹配。微生 物胞内物质代谢网络实质是由伴随能量因子转化与 再生的氧化/还原反应等体系组成;近年研究结果表 明,生物基化学品的合成途径都涉及ATP、NADH 及NADPH等能量因子[13],如何实现微生物细胞内 物质/能量流的高效匹配,对复杂生物原料的高效和 定向转化具有重要的意义。

江南大学等单位针对细胞内酮酸发酵过程的 物质和能量集成原理及关键技术等方面进行了大 量研究。通过对α-酮戊二酸生产菌株Y. lipolytica WSH-Z06进行全基因组测序和分析得到6条多功能 的酮酸转运蛋白,从酮酸转运机制层面揭示了其积 累α-酮戊二酸的机制[14]。基于Y. lipolytica WSH-Z06 发酵生产 α-酮戊二酸过程的特点,建立了一种高通 量筛选方法,快速实现了α-酮戊二酸高产菌株的筛 选[15]。应用比较基因组学分析α-酮戊二酸产量突变 菌株与野生菌株之间的差异,揭示了与α-酮戊二酸 代谢途径相关的控制线粒体合成、调控能量代谢和 调控氨基酸和酮酸转化等基因对α-酮戊二酸的积累 的影响[16]。基于α-酮戊二酸代谢调控机制解析,采 用工业育种与高通量筛选技术相结合的方法,使α-酮 戊二酸转化率达到50.57%。该技术已在5家国内企 业实施,近三年累计新增产值6.21亿元,利税2.43 亿元,出口创汇1902万美元。酮酸发酵法制备关键 技术及产业化获得2015 年国家技术发明二等奖。

在宏观层次上,工业生物过程与工艺的物质/能 量协同作用是生物原料高效转化的另一个关键。北 京化工大学通过把体现工业生物过程特性的物质和 能量传递规律与耦合控制原理相结合,以“原料- 转 化-分离-废物资源化利用”一体化为优化主导思想, 研究胞外工艺过程中的物质流与能量流的匹配规律, 对中粮丰原生化燃料乙醇精馏工段进行了设计和改 造[17]。利用携带高品位能量(如高温)而又需要冷 却的物质流和需要加热的低品位能量物质流进行非 接触式能量交换, 达到加热和冷却耦合的目的;精馏 塔系统由粗塔、精塔和二精塔等组成,塔顶蒸汽采 用不同的压强梯度,高压强的塔顶蒸汽与相邻精馏 塔再沸器进行热交换并作为热源,即利用二精塔的 塔顶蒸汽给精塔再沸器加热,精塔塔顶蒸汽给粗塔 再沸器加热。形成了原料利用合理化、过程能耗最 低化、废物排放和环境污染最小化的生物过程优化 控制和系统优化方法。产量由原来的6万吨/年提升到了11.6万吨/年,蒸汽由原来的2.2吨蒸汽/吨酒精 降低到1.5吨蒸汽/吨酒精,年节约冷却水402万吨, 2015 年新增经济效益1298 万元。

南京工业大学等单位在聚氨基酸工业生物过程 的系统优化原理与调控规律方面进行了深入的研究。 针对因聚氨基酸生物合成机理信息缺乏导致的合成 效率低下的瓶颈,项目组在世界范围内率先对ε-PL (ε-聚赖氨酸)生产菌S. albulus PD-1的全基因组进 行测序(GenBank No :AXDB00000000), 结合中 间代谢产物与关键酶活力检测技术完善了S. albulus PD-1的代谢网络[18]。首次在S. albulus PD-1代谢产 物中发现另一种新型的聚氨基酸——聚二氨基丙酸 (PDAP),并通过加入小分子代谢调节剂,实现了 ε-PL 和PDAP的可控联产,研究发现柠檬酸对ε-PL 和PDAP的共生有明显调控作用,柠檬酸的添加使 得ε-PL合成途径的流量显著增加,胞内还原力水平 提高,有利于ε-PL的合成[19]。ε-PL发酵时间由120h 缩短至80h,比国际最高水平的日本窒素公司耗时少 近一半[20]。聚谷氨酸作为生物高分子,伴随着产物 积累,体系变得十分黏稠,针对营养物质传质困难 的问题,采用放射性14C同位素示踪技术系统研究了 菌株中底物跨膜运输的机理,并针对菌株生长与底 物转运两者最佳pH的不一致,创造性地采用了pH 分步调控策略,提高菌体吸收营养的能力,使底物 转化率达到90.5%的国际最高水平[21]。在以上理论 发现和技术创新的基础上,实现了生物法制备聚氨 基酸高效低成本的系统优化。该研究获得了2014 年 国家技术发明二等奖。

总之,要充分考虑“原料-反应-分离-废物排 放一体化”,进行整个工业生物过程从胞内到胞外的 物质和能量匹配设计,实现物料流和能量流在整个 工业生物过程中的合理分配、副产物和目标产物的 优化调控、废渣废水的最优利用等。

3 过程强化与系统集成是工业生物技术增效 降耗、节能减排的重要手段

过程强化已成为过程工业重要的前沿发展方向。 过程强化可显著提升工业生物过程的转化效率。因 此,探究工业生物过程“三传一反”协同作用机制, 对工业生物过程节能降耗具有重要的意义。

清华大学等单位在从丙烯腈生产丙烯酰胺的过 程强化方面进行了大量的研究。日本和中国分别在 1985年和1994年以野生红球菌和野生诺卡氏菌为生 物催化剂实现了丙烯酰胺的产业化。但在工业生产 过程中一直存在细胞和胞内酶的抗逆性差以及副产 物积累问题,导致原料单耗增加、分离纯化成本提 高、反应效率下降、能耗高以及废水排放多。清华 大学从细胞催化剂性能和过程工艺两个层面进行能 质耦合强化和反应过程强化改造,使生物催化剂在 工业环境中高效稳定运行。

发展了热不对称PCR耦合反向PCR染色体步移 技术;建立了红球菌转座体随机敲除、单基因定点 敲除以及双基因叠加敲除的方法;利用同源单交换 重组,成功敲除了腈代谢酶系中主导副产物生成的 酰胺酶基因,获得了低副产物基因工程红球菌TH3 (ZL200880000969.1)[22]。该红球菌染色体酰胺酶基 因敲除方法,通过了PCT国际专利新颖性、创造性 和工业实用性审查(WO2009/117843),并被授予美 国发明专利(US8518685)。构建的基因工程红球菌 TH3已成功用于丙烯酰胺产业化,解决了生产过程 中副产物积累、原料损耗问题,游离细胞催化水合 副产物量<0.07%,下降70% ~ 80%,精制离子交换 过柱量提高了55%,废水排放下降30%,每年减少9 万吨以上废水排放量,发酵原料成本下降40%,丙烯 腈单耗从0.80 ~ 0.82kg/kg丙烯酰胺下降为0.76kg/kg 丙烯酰胺,接近理论值0.75kg/kg丙烯酰胺。自2009 年8月实现产业化应用到2013年年底,TH3菌株新 增利润2.68亿元,上交税金1.50亿元,创收外汇925 万美元,节支1580 万元,经济和社会效益显著。

开发了游离细胞催化耦合中空纤维超滤膜分离 新工艺[23]。解决了原固定化细胞工艺中酶活损失大、 杂质含量高的问题,菌体利用率提高60%~ 70%, 水合产物杂蛋白降低到5×10-4%以下,游离细胞使 用批次从3 ~ 5批提高到6 ~ 10批,并在年产5 万 吨规模丙烯酰胺工业生产中稳定高效运行,被授予 中国发明专利ZL03109806.1。

以产重组腈水合酶的基因工程红球菌游离细胞 为催化剂的丙烯酰胺生产工艺实现了高效、低耗 (能耗/物耗)、低成本、低排放的全局过程优化,获 得2016年东营市科学技术合作奖及2013年中国石油 和化学工业联合会技术发明二等奖。

再者,工业生物过程是一个上中下游多过程集 成系统,虽已对各单元过程进行了大量的优化研究, 但还缺乏单元子系统之间集成与优化研究,因此工 业生物过程效率仍较低、三废排放高,造成一定环 境问题。

华东理工大学等单位在工业生物过程集成和系 统优化方面做了大量的工作。将用于描述质量与能 量集成和耦合的模型与反应器流场模拟相结合,建 立了一种基于过程流场时空特征的动力学数值模拟 框架[24]。该数值模拟框架由两部分整合而成,其 一,微生物细胞响应外界环境时序改变的动力学数 值模拟;其二,通气搅拌生物反应器中的气液两相 流模拟,以及微生物细胞在反应器流场气液固三相 中的流动轨迹模拟。通过模拟,不仅能够实现对生 物反应器内环境不均一度(底物、溶解氧、前体、 菌体等)的数值模拟,更可以基于不同微生物的历 史经历对其在不同位置的性能(比产物合成速率、 比菌体生长速率、比底物消耗速率、比氧消耗速率 等)进行评估。利用模拟结果更易于针对性地就特 定设备和反应条件的问题提出解决方案,进行理性 优化和放大。这一数值模拟框架已被成功用于青霉 素好氧发酵过程和红花植物细胞培养的研究[25]。以 120m3生物反应器中的青霉素发酵过程为对象,利 用该动力学数值模拟框架对100万个独立颗粒(微 生物簇)进行演算,获得了独立颗粒对流场时空特 性响应的物质能量代谢特征[26]。

在大规模复杂工业生物过程的快速高效多目标 优化算法方面,经过系统分析目前各类智能优化算 法的性能和特点,以局部和全局寻优性能兼备的差 分进化算法为基础,进行适用于大规模复杂工业生 物过程的快速高效多目标优化算法的研发,先后提 出参数自适应的多目标差分进化算法(PBMODE)、 变异策略和参数共同自适应的多目标差分进化算法 (APBMODE)[27],并应用于发酵过程多目标优化问 题的求解,以基于广义计量反应方程和幂级数结构 的发酵动力学模型为基础[28-29],分别构建产物最大 化、底物转化率最大化两个优化目标,以初始菌体 浓度、初始底物浓度、实时溶氧比为优化变量,进 行寻优,获得最佳的优化结果。

上述理论已被成功用于工业化生产,在宜都东 阳光、北方药业、维尔康、山东福洋等企业,实现 了青霉素、红霉素、维生素B12、庆大霉素C1a等多 个产品从实验室规模到工业化规模的放大,产量提 高20%以上。2015 ~ 2016 年实现产值11亿余元。 总之,工业生物过程系统的整体效率受制于系 统内各单元的优化与系统集成,其中某一过程或层 次常常为该系统的限速步骤。因此需要采用系统工 程研究方法确定关键子系统并加以调控,实现整个 工业生物系统的多目标集成与优化。

4 总结与展望

综观我国工业生物技术发展的现状与趋势,生 物技术产业还缺乏集成创新和系统设计研究,造成 复杂生物原料转化效率低、三废排放高等。因此, 急需布局工业生物过程高效转化与系统集成研究。 项目组致力于对生物原料高效/定向生物转化机制、 工业生物技术微观(细胞)和宏观(过程)层次上 的物质和能量耦合规律、过程系统集成与优化原理 等关键科学问题进行深入研究,提出了基于胁迫因 子响应和菌群协同效应的生物高效转化新机制以及 基于物质流与能量流耦合的过程强化新思路,形成 了一批具有一定国际影响力的成果,推动了我国工 业生物技术在过程科学方面的研究。