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肿瘤精准免疫治疗与基因检测

时间:2018-05-29来源:未知 作者:高志博,杨锦 点击:

2016 年发布的《2015 年中国癌症统计》显示, 仅在2015 年,中国共有429.2 万新发肿瘤病例和 281.4 万癌症死亡病例[1]。癌症作为一种成因极其复 杂的疾病,至今没有很好的解决办法,肿瘤异质性 是肿瘤难以根治的主要原因。肿瘤异质性最典型的 体现是个体间的异质性,还包括个体内不同部位或不 同时间发生的异质性,主要表现在癌细胞的基因变化 上,因此才会有各种各样的癌症标志物,并引申出了 癌症分类和个性化治疗的概念。传统的癌症分类是按 照肿瘤发生的部位进行命名和划分的,在基因时代, 对肿瘤的认识上升到分子层面,基因突变越来越被认 为是导致肿瘤的因素。如泛癌症研究就是建立在对多 种肿瘤基因组进行详细分析的基础上对癌症进行分 类,它从基因水平上寻找跨越组织界限的癌症共同特 征,从而让癌症患者得到更为匹配和精准的治疗。 相关研究离不开先进的基因测序和诊断技术的 支撑,测序成本的降低使得癌症测序从实验室走向 市场;而癌症基因组大数据的积累,则为癌症治疗 提供了数据基石,癌症的密码皆藏于双螺旋之中, 解开这一密码将能够实现肿瘤的精准治疗。

越来越多的临床证据表明,许多肿瘤内源性突变会被加工成多肽,呈现到癌细胞表面,被自体免 疫T 细胞识别。高通量测序(NGS)在肿瘤和免疫 学研究中已经显现出巨大的潜力,推动了个体化和 精准免疫治疗的发展,提升了人类对肿瘤基因组和肿 瘤发生发展中细胞内机制的理解[2]。高通量测序解决 了基因数据来源的问题,能快速鉴别出个体化肿瘤的 复杂突变图谱[3];而生物信息分析技术和大数据研究 能从肿瘤基因突变组中找出个体化的肿瘤新生抗原。 在后基因组时代,肿瘤突变组是基因宝库,蕴藏着寻 找肿瘤特异性靶标的肿瘤新生抗原[4]。

人体免疫系统具有天然识别肿瘤细胞并将其清 除的机制,能识别肿瘤细胞中的突变,通过激活机体 对肿瘤特异性抗原的免疫应答防止肿瘤进展,但是各 种原因使免疫细胞失去对肿瘤细胞的控制,导致了肿 瘤发生。肿瘤免疫治疗能够深刻理解肿瘤微环境、 肿瘤和免疫之间的关联性,调动和增强人体免疫系统 对抗癌症的能力,代表了目前最有可能治愈癌症的疗 法。以免疫检验点抑制剂和工程改造T 细胞为代表的 免疫治疗在肿瘤治疗上大放异彩。肿瘤治疗中颇有希 望的免疫治疗与相对成熟的靶向治疗的结合,被公认 为是未来最有希望战胜肿瘤的方向。

1 肿瘤基因突变与免疫的关系

免疫细胞特别是T 细胞时刻监视外在致病原以及机体细胞的改变,并且通过特异性调节机制在肿 瘤发生发展的长期过程中,起着很关键的控制作 用。所以,从某种角度上讲,机体的免疫细胞和肿 瘤一起进化发展,具备识别自身肿瘤的特异性以及 消除肿瘤的能力。但是种种原因致使免疫细胞失去 了对肿瘤的控制能力,导致了肿瘤的发生。

从肿瘤来源角度讲,肿瘤可以被认为是基因组 疾病,一个正常细胞出现体细胞突变,突变积累到一 定程度就会导致肿瘤的发生。突变包括基因融合、基 因拷贝数变化、单碱基突变、原癌基因异常表达、 mRNA 异常剪接、表观修饰调控异常、microRNA 调控异常和DNA 甲基化等。新一代测序技术能检 测出个体肿瘤的全部基因突变图谱[3],由于肿瘤的 异质性,每个肿瘤患者的肿瘤突变印记(mutation signature)特异性非常高,95%以上的突变具有独特 性和患者特异性,所有肿瘤共性的突变非常少,这也 是找到肿瘤特异性抗原非常困难的原因,不仅是靶向 药物治疗难以解决肿瘤异质性难题,这也决定了针对 肿瘤突变多样性的免疫治疗一定是走向精准化的[5]。 肿瘤基因组研究能够从基因水平发掘和认识这些标 志,对于更精细的分子诊断、预后评估和治疗方法的 选择等均具有重要意义,为临床干预肿瘤提供了有效 的个体化监测手段和免疫治疗新靶点[6]。

肿瘤新生抗原是肿瘤突变后产生的能被自体T 细胞识别的突变多肽,激活免疫系统杀伤肿瘤,在 肿瘤免疫临床治疗上发挥了重要作用,如肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)过继免疫治疗和免疫检查点抑制 剂疗法[7]。最近报道了肿瘤免疫治疗领域的引领者 Rosenberg 等[8] 针对KRAS 突变的免疫疗法,瞄准的 就是肺腺癌、结直肠癌中很常见的KRAS 基因突变; 另外,也找到了针对肿瘤新生抗原特异的TIL 细 胞,体外扩增回输后治愈了晚期肝肺转移的胆管 癌患者[9]。肿瘤新生抗原的数量与免疫检验点抑制 剂的疗效相关,已经在肺癌、黑色素瘤和膀胱癌等 癌症的临床试验中得到了验证。

2 基因检测指导的精准免疫治疗

大规模测序技术的发展,尤其是在肿瘤上的 研究,已经积累了海量的肿瘤基因组知识集,既有 TCGA、ICGC 这类的综合数据库,也有专门的肿瘤 基因组数据库、肿瘤DNA 甲基化数据库、肿瘤转录 组数据库、肿瘤蛋白组数据库等,极大提高了研究 人员对肿瘤基因组和肿瘤发生发展机制的了解,基 于这些数据库集,基因检测指导的肿瘤免疫治疗已 经在临床治疗上显现出巨大潜力。通过高通量测序 技术寻找调节免疫应答的信号通路,确定肿瘤生物 标志物,或增强对肿瘤细胞的靶向识别能力,或削 弱肿瘤细胞躲避免疫系统的能力,将助力肿瘤个体 化免疫治疗取得突破。

2.1 免疫检查点抑制剂疗法

PD-1/PD-L1 抗体的药物研发是人类征服肿瘤历 史上的一个关键突破。这些药物的抗肿瘤机制不同 于以往的任何药物,既不是单纯地针对肿瘤,也不 是简单地调节免疫细胞,而是特异性地针对肿瘤微 环境中关键免疫逃逸机制,通过改善肿瘤免疫微环 境来控制和清除肿瘤,瞄准的是免疫系统本身。目 前,这种疗法在美国、欧洲以及日本均获得批准, 在中国的临床试验也已经开始。它在多种肿瘤治疗 中疗效显著,并且效果稳定,副作用比较小,很多 肿瘤病人受益其中。

以PD-1/PD-L1 为代表的免疫检查点抑制剂近 年来好消息不断,除了临床适应证越来越多,新药 上市步伐也不断加快,Keytuda 甚至获批晚期非小细 胞肺癌的一线治疗,免疫检查点抑制剂疗法已经在 一些转移性实体瘤上取得了进展[10-13],由于患者响 应率低(20% 左右),确定哪些患者能从治疗中受 益十分必要。PD-L1 表达是PD-1/PD-L1 阻断剂疗法 的主要检测指标,但是其敏感性和特异性还不足以 预示治疗效果[14-16],肿瘤突变负载(tumor mutation burden,TMB)是肿瘤基因组编码区域内的突变率, 一定时期内具有一致性和可重复性,相关研究评估 证明了TMB 和检查点抑制剂疗法获益性之间的相关 性,分别在黑色素瘤、非小细胞肺癌、转移性黑色 素瘤等的疗效预测上取得进展[17-21]。此外,Webster 在《药物发现自然评论》期刊上撰文预测,到2020 年免疫检查点抑制剂药物的市场规模将达到70 亿美 元[22]。开发中的免疫检查点见表1。

然而,免疫检查点抑制剂疗法还面临治疗响应 率低的问题,主要是因为没有好的标志物预测指导患者用药,这种策略也影响了药厂的临床设计,并带 来不同影响。2016年8月5日,百时美施贵宝公司宣布 了Opdivo一线单药治疗晚期非小细胞肺癌(PD-L1表 达水平≥5%)CheckMate-026 Ⅲ期研究的一线结果, 称其未能到达显著改善无进展生存期(PFS)的主要 终点。但2016年6月16日,默沙东公司宣布Keytruda 一线单药治疗PD-L1高表达[肿瘤比例分值(TPS) ≥50%]晚期非小细胞肺癌的KEYNOTE-024关键Ⅲ 期研究因为到达主要终点[无进展生存期和总生存 期(OS)]而提前终止。类似的药物、类似的临床试 验,由于生物标志物选择标准不一样,一个成功一 个失败,证明了生物标志物对于抗PD-1药物疗效的 重要作用,因此,识别和表征能够预测免疫检查点 抑制剂疗法有效性的生物标志物成为当务之急。

高PD-L1 表达水平能在一定程度上预示免疫疗 法的获益性,但是影响PD-L1 表达水平的因素很多也 很复杂,在某一情况下可能跟预后的相关性较好,但 到了另一个环境,因为免疫系统复杂性,预示效果失 去了作用,最明显的例子是,PD-L1 阴性并不意味着 免疫检查点抑制剂药物就没有作用,事实上PD-1 抑 制剂药物也有可能发挥作用。一些研究发现,肿瘤突 变负载与免疫检查点抑制剂疗法呈正相关[17-18],但突 变负载是肿瘤基因层面的变化,必须转变成能被机 体免疫系统识别的抗原才能触发免疫应答,因此又 有研究人员通过全外显子测序和RNA 测序寻找肿瘤 突变后产生的抗原标志物——肿瘤新生抗原,通过 测定肿瘤细胞编码区和已表达的基因,筛选出肿瘤新 生抗原,测定其中与人类白细胞抗原(HLA)受体亲和 力相关的抗原表位找到更适合患者的治疗方案,实现 个性化的肿瘤免疫治疗。精选出的肿瘤新生抗原能被 用于个体化肿瘤疫苗开发和过继性T 细胞治疗。RNA 测序还可用于寻找能影响免疫检查点抑制剂疗法有效 性的细胞因子、亚细胞和肠道微生物群落等肿瘤微环 境因素。

2.2 个体化肿瘤疫苗

2016 年12 月1 日, 美国旧金山的帕克研究所和纽约的癌症研究所发起肿瘤新抗原筛查联盟 (Tumor neoantigEn SeLection Alliance,TESLA), 目前已有30 家机构参与,包括顶级基因组研究机 构Broad 研究所,以及百时美施贵宝、阿斯利康这 样的领军药企。TESLA 联盟成立的目标,是为了 规范和引领肿瘤新生抗原选择的算法,联盟内的30 家实验室将用各自的算法对同一DNA 和RNA 序列 进行预测,希望可以找到最准确的算法,以便用于 个性化肿瘤疫苗的设计,其可以应用于肿瘤疫苗领 域,也可以应用于PD-1 抗体药物的生物标志物分 析领域。

肿瘤疫苗的理念源自于免疫系统对外来抗原的 杀灭机制,与过去几十年来寻找肿瘤共同抗原来激 发免疫系统杀死肿瘤相比,关注肿瘤基因组异质性 和抗原差异性的个体化肿瘤疫苗近年来引起更多关 注。2010 年美国食品药品监督管理局(FDA)批准 了首个癌症治疗疫苗Provenge 用于晚期前列腺癌 的治疗,但其效果有限,病人接种疫苗后平均存活 时间只延长4 个月,而且治疗费用昂贵,开发公司 Dendreon 也几经易手。肿瘤疫苗早期研发失败的部 分原因可能是之前的疫苗开发策略是将全部细胞降 解物作为抗原,导致有效免疫原被无关的抗原掩盖。 2015 年,Mardis 等对3 位黑色素瘤患者使用了针对 其潜在肿瘤抗原所定制的树突细胞疫苗,成功地触 发了患者的免疫反应[23]。2016 年,《自然》杂志专 门介绍了癌症免疫疗法中的个性化肿瘤疫苗[24]。 在国外,同时成立于2015 年10 月的两家致力 于癌症新抗原的免疫治疗公司:Neon Therapeutics 公司和Gritstone Oncology 公司,分别进行了5500 万美元和1.05 亿美元的A 轮融资。

NGS 技术的进步使得研究人员有望预测出引 发肿瘤特异性免疫反应的肿瘤新生抗原,外显子 测序和转录组测序能准确表征肿瘤细胞的DNA 和 RNA,找出可能引起免疫细胞识别的肿瘤突变,生 物信息学工具的发展则提高了肿瘤新生抗原的筛选 能力[23,25-26],基因组大数据和计算机算法加速了肿 瘤表位预测以及主要组织相容性复合体(MHC)亲和 力预测,推动了个体化肿瘤疫苗的发展[27-28]。

2.3 过继性T 细胞治疗

过继性细胞免疫治疗(ACT)是将体外培养、 活化、基因修饰的自体、异体T 细胞或NK 细胞回 输给患者,旨在利用这些体外“驯化”细胞所拥有的 强大抗肿瘤或抗病毒活性来治疗疾病。以CAR-T、 TCR-T 为代表的过继性T 细胞肿瘤免疫治疗具有常 规治疗无法比拟的疗效和临床前景,已成为全球肿瘤 治疗研发和临床试验的热点。目前过继性细胞免疫治 疗已经进入2.0 时代,不再是简单地将免疫细胞与肿 瘤共培养再回输,而是先筛选出最有可能使肿瘤引起 免疫响应的肿瘤新生抗原,再与免疫细胞共培养获得 特异性靶向病人肿瘤的免疫细胞,回输病人体内。

例如,肿瘤外显子测序已经发现,TIL 细胞能 识别和靶向肿瘤突变后形成的肽段,将肿瘤新生抗 原与肿瘤组织在体外共培养,筛选得到特异性靶向 肿瘤的TIL 细胞回输体内,激活病人免疫系统杀伤 肿瘤的能力,其在黑色素瘤中效果最好。最近报道 的Rosenberg 研究组的针对KRAS 突变的免疫疗法, 即是从一位已经发生肺转移的大肠癌患者的肿瘤组 织里分离出了对突变的KRAS 特异性作用的CD8+T 细胞,这些T 细胞在体外扩大培养后回输到病人体 内,将病人体内肿瘤一举歼灭[8]。

CAR-T 细胞治疗主要是通过基因修饰获得携带 识别肿瘤抗原特异性受体T细胞的个性化治疗方法, 但由于涉及基因修饰,规模化生产和病毒稳定性均 面临诸多技术障碍。另外,好的特异性靶点也是关 键[29-30],CAR-T 技术所针对的靶点是表达在肿瘤细 胞膜上的肿瘤相关抗原,可选择的范围较窄,特异 性较差。如表达于B 细胞淋巴瘤细胞表面的CD19 蛋白,也会在正常B 细胞上表达,但在造血干细胞 中不表达,因此副作用只局限在B 细胞。因此, CAR-T 技术所选用的效应细胞来源是个性化的,但 治疗靶点是非个性化的,无需通过高通量的检测手 段配合。相比而言,基于肿瘤新生抗原的细胞治疗, 针对的是患者自身肿瘤产生的肿瘤特异性抗原,靶 点类型更加丰富,无需对细胞进行人工改造,但必 须通过基因检测对肿瘤基因组状态有全面了解[31]。

2.4 靶向治疗+ 免疫治疗

在癌症治疗各种手段中,最早也是最直接的是 肿瘤切除,但前提是将体内的肿瘤组织完全拔除, 不留任何肿瘤组织,如休眠癌细胞、耐药性癌细胞、 转移肿瘤、手术中的脱落肿瘤等。然后是放化疗,化疗是化学药物作用于癌细胞的合成代谢途径,放 疗是利用射线照射肿瘤部位杀死癌细胞。化疗是目 前研究的重点,占了很大的比例,现在的化疗方式 已经逐渐走向智能化,也就是人们常听到的靶向治 疗,根据癌细胞与正常细胞的物理化学以及基因层 面上的不同,特异性地针对癌细胞的一个或多个特 征,因此,才不断地有新的肿瘤标志物出现。然而 靶向治疗面临着耐药性的问题,一旦肿瘤细胞产 生耐药突变,便会导致靶向药失效,考虑到肿瘤 基因组的不稳定特性,靶向药将很难一劳永逸地解 决肿瘤。

肿瘤免疫治疗是目前最有可能治愈癌症的疗法, 但也面临一些问题,如PD-1 抑制剂的治疗有效性只 有20% ~ 30%,即使是PD-L1 高表达的肿瘤,如非 小细胞肺癌中,其治疗有效性也只有30% 左右。有 效性相对低的原因可能是,肿瘤免疫治疗的检测比 肿瘤靶向药物治疗的检测更加复杂,涉及的问题很 多,包括基因是否表达、是否有足够的浸润淋巴细 胞或γ-干扰素、是否有相关的突变等。

靶向治疗依托肿瘤基因组测序找出肿瘤相关性 和特异性的生物标志物,有望弥补免疫治疗受益人 群不精准的问题。从长远角度看,肿瘤未来治疗的 最有效方案可能是靶向治疗+ 免疫治疗。

华盛顿大学医学院基因组研究所主任Mardis 研究团队,首先对数名黑色素瘤患者肿瘤及健康组 织样本的基因组进行了测序,鉴别出肿瘤细胞独有 的突变抗原,即肿瘤新生抗原,然后利用计算机算 法及实验室测试,预测出哪些新生抗原最有可能激 发有力的免疫反应并进行测试,最后根据这些结果 开发出个体化的癌症疫苗,研究结果也证实了这些 定制的疫苗可以激发强有力的免疫反应。尽管还只 是初步的结果,但研究证明了基于免疫的个体化癌 症治疗的可行性[23]。

在商业运作方面,FoundationOne 是Foundation Medicine 公司与纪念斯隆凯特琳癌症中心联合开发 的第一个商业癌症全基因检测项目,FoundationOne 检测实体瘤中常见的315 个癌症相关基因和28 个 基因的选择内含子,通过对每个癌症患者的基因改 变匹配不同的治疗药物和临床试验,补充传统癌症 治疗决策工具。此外,Foundation Medicine 公司用 WES 测序和Panel 测序分别评价了突变负载,发现 结果是相关的,表明可以用一个Panel 检测突变负载, 来预测免疫检验点抑制剂的治疗效果,突变负载是 识别免疫治疗效果的待选标志物之一。

但是,肿瘤的体细胞突变负载并不是最有效或 者最直接的免疫检验点抑制剂相关位点检测的生物 标志物,基因突变导致的肿瘤新生抗原才是肿瘤能 被T 细胞识别并杀伤的关键点。在肿瘤新生抗原负 载的评估方面,其质量是比数量更重要的评估方面。 突变是否克隆、是否表达、表达强度,肿瘤新生抗 原亲和力、递呈效率等都是影响肿瘤新生抗原质量 的因素。

3 总结与展望

最近几十年来,研究人员对免疫系统在肿瘤发 生发展中的作用和认识有了很大进展,基于对免疫 系统与肿瘤相互作用的深刻认识,新的免疫疗法不 断发展,已经在部分癌症患者上取得良好的临床进 展。肿瘤免疫治疗副作用低于传统放化疗,且能持 续对抗进化的肿瘤系统,然而,由于目前的免疫治 疗手段还不够精准,利用免疫系统杀伤肿瘤的同时 也不可避免对正常组织造成自身免疫反应,并且目 前免疫治疗还只能对一小部分癌症患者有效果。基 于肿瘤特异性抗原(TSAs)的个体化肿瘤治疗有望 使未来的肿瘤免疫治疗特异性更强,有效性更高, 安全性更好,实现这一目标的过程中还有许多科学 问题有待解决,例如基因突变是否能检测到、肿瘤 特异性突变抗原与非突变性肿瘤相关抗原效果对比、 新抗原表位最低阈值等,最后还需要通过试验确定 相关抗原不会导致不可控的自身免疫响应,然后才 能根据这些信息确定适合患者的个性化肿瘤免疫治 疗方案:是个性化肿瘤疫苗、还是精准过继性细胞 治疗、还是跟免疫检查点抑制剂疗法结合、还是与 传统放化疗手段联用等?

所有这一切都离不开肿瘤基因组大数据研究和 算法分析,全基因组、外显子、转录组、免疫组等 测序技术因能对肿瘤- 免疫学过程的发现、理解提 供更为全面的认识,越来越成为肿瘤免疫治疗不可 缺少的关键,而生物信息学分析和人工智能结合提 供了预测肿瘤变异和新生抗原的前沿工具。这些方 法将从更加全面的肿瘤基因大数据中寻找能揭示特定免疫治疗获益性临床指标和治疗靶点。 可以预见的是,为了实现肿瘤精准免疫治疗的目 标,找出适合病患的个体化治疗方案,需要对包括免 疫检查点分子的表达、肿瘤突变负载、预测性肿瘤新 生抗原、肿瘤微环境、肠道菌群组成等众多影响因素 进行全面的评估,基因检测与生物信息学分析将能够 为理解免疫系统和肿瘤之前相互关系搭建一座桥梁。 基于高通量测序的生物标志物发现,基于生物信息分 析的大数据研究将指引更加精确的肿瘤免疫治疗。